合成基因組學
編輯合成基因組學是合成生物學的新興領域,它利用對已有生命形式的遺傳修飾或人工基因合成來創造新的DNA或整個生命形式。
概述
合成基因組學不同于遺傳修飾,因為它在生命形式上不使用天然存在的基因。它可利用的定制設計的堿基對序列,盡管在一個更加擴大的和目前未實現的意義上合成的基因組學可以利用未由遺傳碼2個堿基對的DNA當前使用由壽命。
合成基因組學的發展與遺傳學領域的某些最新技術能力和技術有關。廉價,準確地大規模構建長堿基對鏈的能力使研究人員能夠對自然界中不存在的基因組進行實驗。加上蛋白質折疊模型的發展和計算成本的降低,現場合成基因組學開始進入生機勃勃的階段。
重組DNA技術
編輯在發現限制性核酸內切酶和連接酶后不久,遺傳學領域開始使用這些分子工具從合成或天然存在的DNA的較小片段中組裝人工序列。與連續DNA合成相反,使用重組方法的優勢在于合成DNA長度與該合成長度的純度百分比之間存在反比關系。換句話說,當您合成更長的序列時,由于當前技術的固有錯誤率,包含錯誤的克隆數會增加。盡管重組DNA技術更常用于融合蛋白和質粒的構建,已經出現了一些具有更大容量的技術,可以構建整個基因組。
聚合酶循環裝配
聚合酶循環裝配(PCA)使用一系列大約40至60個核苷酸長的寡核苷酸(或寡核苷酸),它們共同構成了要合成的DNA的兩條鏈。這些寡核苷酸被設計成使得來自一條鏈的單個寡核苷酸在每個末端包含約20個核苷酸的長度,該長度與相反鏈上的兩個不同寡核苷酸的序列互補,從而產生重疊區域。整個過程通過以下循環進行:(a)在60°C雜交;(b)通過Taq聚合酶和標準連接酶的延伸;(c)在95°C變性,形成逐漸更長的連續鏈,并最終形成最終的基因組。PCA用于產生歷史上xxx個合成基因組,即Phi X 174病毒。
吉布森裝配法
由丹尼爾·吉布森(Daniel Gibson)在J.克雷格·文特學院(J. Craig Venter Institute)任職期間設計的吉布森組裝方法需要一組構成整個合成基因組的雙鏈DNA盒。注意,盒的定義與重疊群不同,因為這些序列包含與其他盒同源的區域以便重組。與聚合酶循環組裝不同,吉布森組裝是一步式等溫反應,具有更大的序列長度能力。因此,它可用于代替大于6 kb的基因組的聚合酶循環裝配。
甲T5核酸外切酶進行在終端段咀嚼回反應,在5'個工作至3'方向,由此產生互補的突出端。突出端彼此雜交,Phusion DNA聚合酶填充任何缺失的核苷酸,并且切口用連接酶密封。然而,僅能使用這種方法合成的基因組是有限的,因為隨著DNA盒長度的增加,它們需要在體外??繁殖才能繼續雜交。因此,吉布森裝配通常與轉化相關重組結合使用以合成大小為幾百千個堿基的基因組。
與轉化相關的重組
合成基因組學中的轉化相關重組(TAR)技術的目標是通過酵母人工染色體(YAC)進行的同源重組來結合DNA重疊群。重要的是YAC載體中的CEN元件,其對應于酵母著絲粒。該序列使載體具有以染色體方式表現的能力,從而使其能夠進行同源重組。
首先,進行缺口修復克隆以產生DNA重疊群側翼的同源區域。缺口修復克隆是聚合酶鏈反應的一種特殊形式,其中利用了延伸超過DNA靶序列的專門引物。然后,將DNA盒暴露于YAC載體,該YAC載體驅動同源重組的過程,從而連接DNA盒。聚合酶循環裝配和TAR技術在2008年一起用于構建600 kb生殖支原體基因組,這是有史以來xxx個合成生物。在合成較大的支原體時也采取了類似的步驟幾年后的基因組。
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