絲氨酸蛋白酶（或絲氨酸內肽酶）是酶的是切割肽鍵在蛋白質，其中絲氨酸作為親核氨基酸在（酶的）活性位點。它們普遍存在于真核生物和原核生物中。絲氨酸蛋白酶根據其結構分為兩大類：胰凝乳蛋白酶樣（胰蛋白酶樣）或枯草桿菌蛋白酶樣。

在MEROPS蛋白酶分類系統16個計數超家族（如2013），每個包含許多家庭。每個超家族使用催化三聯體在不同的或成對蛋白質折疊等代表趨同進化的的催化機制。大多數屬于蛋白酶的PA家族（超家族）的S1家族。

對于超家族，P=超家族，包含親核類家族的混合物，S=純絲氨酸蛋白酶。超家族。在每個超家族中，家族由其催化親核試劑指定（S=絲氨酸蛋白酶）。

絲氨酸蛋白酶的特點是具有獨特的結構，由兩個在催化活性位點會聚的β-桶結構域組成。這些酶可以根據它們的底物特異性進一步分類為胰蛋白酶樣、胰凝乳蛋白酶樣或彈性蛋白酶樣。

胰蛋白酶樣蛋白酶在帶正電荷的氨基酸（賴氨酸或精氨酸）之后切割肽鍵。這種特異性是由位于酶S1口袋底部的殘基驅動的（通常是帶負電荷的天冬氨酸或谷氨酸）。

胰凝乳蛋白酶樣酶的S1口袋比胰蛋白酶樣蛋白酶更疏水。這導致對中到大尺寸疏水殘基的特異性，例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

這些包括凝血酶、組織激活型纖溶酶原和纖溶酶。已發現它們在凝血和消化以及神經退行性疾病（如阿爾茨海默氏癥和帕金森氏誘發的癡呆癥）的病理生理學中發揮作用。

彈性蛋白酶樣蛋白酶的S1裂縫比胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶小得多。因此，殘基如丙氨酸、甘氨酸和纈氨酸往往是優選的。

枯草桿菌蛋白酶是原核生物中的一種絲氨酸蛋白酶。枯草桿菌蛋白酶在進化上與胰凝乳蛋白酶家族無關，但具有相同的催化機制，利用催化三聯體來產生親核絲氨酸。這是用來說明趨同進化的經典例子，因為同一機制在進化過程中獨立進化了兩次。

絲氨酸蛋白酶催化機制的主要參與者是催化三聯體。三聯體位于酶的活性位點，在那里發生催化作用，并保存在絲氨酸蛋白酶的所有超家族中。三聯體是由三個氨基酸組成的協調結構：His57、Ser195（因此得名“絲氨酸蛋白酶”）和Asp102.這三種關鍵氨基酸均在蛋白酶的切割能力中發揮重要作用。雖然三聯體的氨基酸成員在蛋白質序列上彼此遠離，但由于折疊，它們在酶的核心彼此非常接近。三元組成員的特定幾何形狀對其特定功能具有高度特征：表明三元組中僅四個點的位置表征了包含酶的功能。

在催化的情況下，會發生一種有序的機制，其中會生成幾個中間體。肽裂解的催化可以看作是乒乓催化，其中底物結合（在這種情況下，多肽被裂解），一個產物被釋放（肽的N端“一半”），另一個底物結合（在這種情況下是水），并釋放另一種產物（肽的C端“一半”）。

三聯體中的每個氨基酸在此過程中執行特定任務：

• 所述絲氨酸具有-OH基團，其能夠充當親核試劑，攻擊羰基的碳的易斷裂的基板的肽鍵。
• 組氨酸氮上的一對電子具有從絲氨酸-OH基團接受氫的能力，從而協調肽鍵的攻擊。
• 在羧基上的組天冬氨酸反過來氫鍵與組氨酸，使氮原子上述更加電負性。

整個反應可以概括如下：

• 所述多肽底物結合到所述絲氨酸的表面蛋白酶，使得所述易斷裂鍵被插入到酶的活性部位，與該鍵位于靠近的羰基碳的親核絲氨酸。
• 所述絲氨酸-OH攻擊羰基碳，和中的氮組氨酸接受從的-OH和從的雙鍵的一對電子的氫羰基氧移動到氧。結果，生成了四面體中間體。
• 肽鍵中連接氮和碳的鍵現在被破壞了。產生這種鍵的共價電子移動攻擊組氨酸的氫，破壞連接。先前從羰基氧雙鍵移出的電子從負氧移回以重建鍵，生成酰基酶中間體。
• 現在，水進入反應。水取代裂解肽的N端，并攻擊羰基碳。再一次，當水的氧和碳之間形成鍵時，來自雙鍵的電子移動到氧上，使其變為負電。這是由組氨酸的氮協調，它接受來自水中的質子。總的來說，這產生了另一個四面體中間體。
• 在最后的反應中，絲氨酸和羰基碳之間在xxx步中形成的鍵移動以攻擊組氨酸剛剛獲得的氫。現在缺電子的羰基碳與氧重新形成雙鍵。結果，肽的C端現在被彈出。

發現蛋白酶的其他氨基酸Gly193和Ser195參與產生所謂的氧陰離子孔。兩個甘氨酸193和絲氨酸195可以捐贈骨干氫為氫鍵。當生成步驟1和步驟3的四面體中間體時，負氧離子接受了來自羰基雙鍵的電子，完全適合氧陰離子空穴。實際上，絲氨酸蛋白酶優先結合過渡態有利于整體結構，降低反應的活化能。這種“優先結合”是酶的大部分催化效率的原因。

宿主生物必須確保絲氨酸蛋白酶的活性得到充分調節。這是通過對初始蛋白酶激活和抑制劑分泌的要求來實現的。

酶原是酶的通常無活性的前體。如果消化酶在合成時活躍，它們會立即開始咀嚼合成器官和組織。急性胰腺炎就是這樣一種情況，其中胰腺中的消化酶過早激活，導致自我消化（自溶）。它還使死后調查復雜化，因為胰腺通常會在進行肉眼評估之前自行消化。

酶原是大的、無活性的結構，能夠分解或變成較小的活化酶。酶原和活化酶之間的區別在于，酶原催化的活性位點是扭曲的。結果，底物多肽不能有效結合，不發生蛋白水解。只有在激活后，酶原的構象和結構發生變化，活性位點被打開，才能發生蛋白水解。

某些抑制劑類似于四面體中間體，因此會填滿活性位點，阻止酶正常工作。胰蛋白酶是一種強大的消化酶，在胰腺中產生。抑制劑阻止胰腺自身的自我消化。

絲氨酸蛋白酶與絲氨酸蛋白酶抑制劑配對使用，當不再需要它們時會關閉它們的活性。

絲氨酸蛋白酶被多種抑制劑抑制，包括用于研究或治療目的的合成化學抑制劑，以及天然蛋白質抑制劑。一類稱為“絲氨酸蛋白酶抑制劑”（縮寫為絲氨酸蛋白酶抑制劑）的天然抑制劑可以與絲氨酸蛋白酶形成共價鍵，從而抑制其功能。研究最多的絲氨酸蛋白酶抑制劑是抗凝血酶和α1-抗胰蛋白酶，分別研究了它們在凝血/血栓形成和肺氣腫/A1AT中的作用。人工不可逆小分子抑制劑包括AEBSF和PMSF。

已經在蝗蟲和小龍蝦中發現了一個名為pacifastin的節肢動物絲氨酸肽酶抑制劑家族，并且可能在節肢動物的免疫系統中起作用。

突變可能導致酶活性降低或增加。這可能會產生不同的后果，具體取決于絲氨酸蛋白酶的正常功能。例如，蛋白C的突變會導致蛋白C缺乏和易患血栓形成。此外，一些蛋白酶通過引發病毒的Spike蛋白顯示名為“融合蛋白”的蛋白質（TMPRSS2激活SARS-CoV-2融合），在宿主細胞-病毒融合激活中發揮著至關重要的作用。

絲氨酸蛋白酶水平的測定在特定疾病的背景下可能有用。

• 在診斷出血性或血栓性病癥時可能需要凝血因子水平。
• 糞便彈性蛋白酶用于確定胰腺的外分泌活性，例如在囊性纖維化或慢性胰腺炎中。
• 血清前列腺特異性抗原用于前列腺癌篩查、風險分層和治療后監測。
• 由肥大細胞釋放的絲氨酸蛋白酶是1型超敏反應（例如過敏反應）的重要診斷標志物。由于更長的半衰期，比組胺更有用，這意味著它在系統中保留臨床有用的時間長度。