脯氨酰異構酶是一種存在于原核生物和真核生物中的酶(EC5.2.1.8)，可將肽鍵的順式和反式異構體與氨基酸脯氨酸相互轉化。脯氨酸由于其側鏈與仲胺氮鍵合的環狀結構而具有異常構象受限的肽鍵。大多數氨基酸對由于空間位阻導致的反式肽鍵構象，但脯氨酸的不尋常結構穩定了順式形式，因此兩種異構體都在生物學相關條件下聚集。具有脯氨酰異構酶活性的蛋白質包括親環蛋白、FKBPs和parvulin，盡管較大的蛋白質也可以包含脯氨酰異構酶結構域。

脯氨酸在天然氨基酸中的獨特之處在于其肽鍵的順式構型與更常見的反式構型之間的自由能差異相對較小。催化順式和反式之間的異構化所需的活化能相對較高：~20kcal/mol（參見常規肽鍵的~0kcal/mol）。與常規肽鍵不同，X-脯氨酰肽鍵不會自發形成預期的構象，因此順反異構化過程可能是蛋白質折疊過程中的限速步驟.因此脯氨酰異構酶充當蛋白質折疊伴侶。順式肽鍵的N端與脯氨酸殘基通常位于蛋白質骨架中某些類型的緊密轉角的xxx個殘基處。天然狀態下含有結構順式脯氨酸的蛋白質包括核糖核酸酶A、核糖核酸酶T1、β內酰胺酶、親環素和一些白細胞介素。

脯氨酰異構酶折疊可以是自催化的，因此折疊速度取決于反應物濃度。Parvulin和人類細胞溶質FKBP被認為可以催化它們自己的折疊過程。

鑒定蛋白質折疊事件中是否存在限速脯氨酸異構化過程的方法包括：

1. 與脯氨酸異構化一致的活化能，其通常具有約20kcal/mol的活化能。
2. 表明處于未折疊或變性狀態的快速折疊和慢速折疊種群的雙態折疊動力學。
3. “雙跳”測定，其中含脯氨酸的蛋白質被展開和重新折疊，并且研究非天然脯氨酸構象的群體作為折疊程度的函數。
4. 通過添加脯氨酰異構酶加速體外折疊速率。
5. 在一個或多個脯氨酸殘基被另一種氨基酸取代的突變蛋白變體中加速體外折疊率。

值得注意的是，并非每個脯氨酸肽鍵對蛋白質的結構或功能都至關重要，也不是每個這樣的鍵對折疊動力學都有重大影響，尤其是反式鍵。此外，一些脯氨酰異構酶具有一定程度的序列特異性，因此在某些序列環境中可能不催化脯氨酸的異構化。

脯氨酰異構酶活性首先是使用基于糜蛋白酶的測定法發現的。僅當脯氨酸肽鍵處于反式狀態時，蛋白水解酶糜蛋白酶對四殘基肽Ala-Ala-Pro-Phe具有非常高的底物特異性。將胰凝乳蛋白酶添加到含有具有該序列的報告肽的溶液中會導致約90%的肽快速裂解，而那些具有順式脯氨酸鍵的肽-在水溶液中約為10%-以受未催化的脯氨酸異構化限制的速率裂解。如果它具有真正的脯氨酰異構酶活性，則添加潛在的脯氨酰異構酶將加速后一反應階段。