• 自動膜片鉗

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    自動膜片鉗

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    自動膜片鉗正開始取代手動膜片鉗作為測量單個細胞電活動的方法。不同的技術被用于自動化細胞培養和體內細胞的膜片記錄。自1990年代后期以來,研究實驗室和公司一直在進行這項工作,試圖降低手動膜片鉗的復雜性和成本。長期以來,膜片鉗被認為是一種藝術形式,仍然非常耗時且乏味,尤其是在體內。自動化技術試圖減少用戶在從單細胞獲取高質量電生理記錄時的錯誤和可變性。

    自動化系統

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    自動化技術因細胞周圍環境而異。對于體內的細胞,這通常意味著細胞在大腦中并被其他細胞包圍。這種環境還包含血管突、軸突和神經膠質細胞,它們通過堵塞直徑為1-2μm的移液器尖端而更難形成gigaseal。在這里,如上所述,精確控制移液器尖端的壓力和位置在防止堵塞和檢測細胞是否靠近移液器尖端方面發揮著重要作用。

    體外細胞可以懸浮在液體中,使其粘附培養皿上,或者保留從動物身上取出的一塊組織的一部分。由于動物的心跳或呼吸,這些環境通常不必補償組織的運動。在細胞處于懸浮狀態的情況下,移液器完全被一個帶有孔的微芯片取代,該孔可以產生千兆密封并測量電活動。對于培養皿中的細胞或組織而言,堵塞問題也較小,因為可以通過顯微鏡看到細胞和移液器,這有助于技術人員避開除感興趣細胞之外的所有物體。

    這些自動化系統中的每一個都必須執行多項任務。它必須將細胞放置在移液器尖端或其他帶有1-2μm孔的設備旁邊,控制孔處的壓力,并控制細胞內的電壓

    體內

    Kodandaramaiah等人展示了體內膜片鉗的一個例子。在這種情況下,壓力控制由一組電子閥和電子壓力調節器組成,以提供以前由技術人員提供的三種壓力(高壓800-1000mbar、低壓20-30mbar和小真空15-150毫巴)。三個電子閥在三種壓力和大氣壓之間切換。高壓用于防止堵塞移液器,低壓用于尋找細胞,真空用于幫助密封過程。這些都由計算機控制,隨著移液管尖端阻力的變化,在壓力中進行選擇。

    在這種情況下,手動位置控制被計算機控制的壓電顯微操縱器所取代,該微操縱器將移液器以離散的2-3μm步長移動到組織中,直到它與細胞接觸。這種精確控制比手動定位更加準確和可重復,并且不需要操作員。

    當移液器與細胞接觸時,計算機還會計算和跟蹤電阻的變化。它以方波的形式沿移液管向下發送電壓信號,該信號從移液管末端流出或被細胞膜阻擋。當膜阻擋它時,計算機停止移液器的運動并施加吸力以形成千兆密封。這種自動化消除了技術人員必須執行的決策,并且與技術人員不同,計算機可以不知疲倦地以更高的精度執行這些任務。

    所有這些步驟都按照與手動膜片鉗相同的邏輯順序執行,但不需要大量培訓即可執行,并且完全由計算機控制。這減少了獲得膜片鉗記錄所需的費用,并增加了在活腦中記錄的可重復性和穩健性。

    暫停

    已經開發了許多類型的系統用于懸浮培養中的膜片鉗細胞。一個系統使用傳統的移液器和液滴懸浮培養中的細胞來獲得膜片鉗記錄(見圖)。這具有使用傳統移液器制造系統的額外好處,該系統加熱玻璃毛細管并將其縱向拉動以形成用于膜片鉗的錐形尖端。

    更常見的懸浮培養自動化系統使用在平面基板上帶有微小(1-2μm)孔的微芯片而不是移液器來創建gigaseal并從單細胞記錄。由于半導體行業開發的微細加工技術的改進,貼片芯片是在2000年代初期開發的。芯片通常由硅、玻璃、PDMS、聚酰亞胺制成。貼片芯片系統通常更復雜、更昂貴,但具有并行和免提操作的額外好處。

    通常,神經元不會在懸浮培養中生長,但其他細胞類型可以。有些可以用基因轉染以產生感興趣的膜離子通道。這意味著通常沒有電活動的細胞可以在其膜中生長離子通道,從而產生離子電流。由于細胞在懸浮培養中彼此分離,因此可以精確測量單個細胞中的離子電流。這使研究人員能夠在不受其他細胞干擾的情況下研究離子通道行為在更受控的環境中,這通常發生在神經網絡中。這在目標是特定蛋白質的藥物篩選研究中特別有用。由于處理懸浮細胞比處理培養或體內細胞要容易得多,因此可以更快、更可靠地獲得膜片鉗記錄,從而提高生產力,使篩選數千種化合物成為可能。

    來自貼壁培養的干細胞的神經元可以被提升到懸浮液中,并已成功用于平面膜片鉗裝置。使用自動和手動膜片鉗從這些細胞記錄離子通道,例如電壓門控鈉通道、電壓門控鉀通道和配體GABA打開的離子型配體門控離子通道。

    在文化

    一種使用貼片芯片,如上面討論的那些,以及導致培養細胞遷移到孔口的表面處理,這些孔在它們生長時形成gigaseal。通過讓神經元在培養物中生長,它們自發地形網絡,就像大腦中的網絡一樣,它更像是天然組織,而不是懸浮的孤立細胞。

    自動膜片鉗

    在另一種方法中,細胞從動物身上取出并在貼片芯片上培養2-4小時,因為它們會自發地與聚酰亞胺和PDMS貼片芯片形成gigaseals該系統不需要外部設備即可形成gigaseals。

    另一種技術使膜片鉗細胞在培養物中的定位自動化。它在精確的壓電驅動平臺上使用納米吸管來掃描培養皿內的表面。當它掃描時,它通過上下移動移液器尖端和其下方的表面或細胞之間保持恒定的電容。(當它靠近細胞移動時,電容會增加,因此致動器將移液器移開,反之亦然。)這給出了培養皿內表面的精確地形圖。在細胞被映射后,計算機將移液器移至選定的細胞并降低它以與它形成一個gigaseal。

    另一種技術只是使仔細與細胞接觸的業務自動化。操作員將移液器放在樣品上,然后讓自動化軟件接管,降低移液器并試圖檢測移液器與細胞接觸時阻力的增加。此時該過程結束,技術人員手動創建gigaseal。

    開發和接受

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    膜片鉗自動化儀器于2003年開始商業化。由于最初的高成本,這項近20年的技術最初旨在服務生物技術和制藥行業,但在過去幾年中,它在學術界和非營利組織中的存在不斷增長,鑒于其日益成熟的技術可靠性和成本的相對可及性。越來越多的大學和其他學術機構現在擁有配備膜片鉗自動化設備的實驗室和核心設施,這些設備與其他相關或互補的技術和方法相結合并共存。自動化膜片鉗電生理學的接受和認可反映在發表的科學文獻的指數增長中,并通過這種xxx性的新技術獲得了結果。

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    4. 暫停
    5. 在文化
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