蛋白質結構的互動圖，以PCNA為例。(PDB:1AXC)蛋白質二級結構是蛋白質局部片段的三維形式。兩個最常見的二級結構元素是α螺旋和β片，盡管也有β轉折和歐米茄環。二級結構元素通常是在蛋白質折疊成其三維三級結構之前自發形成的一種中間物。二級結構是由肽骨架中的氨基氫原子和羧基氧原子之間的氫鍵模式正式定義的。二級結構也可以根據拉馬錢德蘭圖中某一特定區域的骨架二面角的規律模式來定義，而不管它是否有正確的氫鍵。二級結構的概念于1952年在斯坦福大學首次提出。其他類型的生物聚合物，如核酸，也擁有特征性的二級結構。

蛋白質二級結構中氫鍵的互動圖。上面的漫畫，下面的原子，氮為藍色，氧為紅色（PDB:1AXC)最常見的二級結構是α螺旋和β片。其他的螺旋，如310螺旋和π螺旋，經計算具有能量上有利的氫鍵模式，但在天然蛋白質中很少觀察到，除非是在α螺旋的末端，因為螺旋中心的骨架包裝不利。其他的延伸結構，如多肽螺旋和α片，在原生狀態的蛋白質中很少見，但經常被假設為重要的蛋白質折疊中間產物。緊密的轉折和松散、靈活的環狀結構將更多的規則二級結構元素聯系起來。隨機線圈不是一個真正的二級結構，但卻是表明沒有規則二級結構的一類構象。氨基酸在形成各種二級結構元素的能力上有所不同。脯氨酸和甘氨酸有時被稱為螺旋體破壞者，因為它們破壞了α螺旋骨架構象的規則性；然而，兩者都有不尋常的構象能力，并且常見于輪回中。在蛋白質中喜歡采用螺旋構象的氨基酸包括蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和賴氨酸（氨基酸1字母代碼中的MALEK）；相比之下，大的芳香族殘基（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）和Cβ支鏈氨基酸（異亮氨酸、纈氨酸和蘇氨酸）喜歡采用β鏈構象。然而，這些偏好還不足以產生一種可靠的方法，僅從序列上預測二級結構。低頻集體振動被認為對蛋白質內部的局部剛度很敏感，揭示出β結構一般比α或無序蛋白質的剛度大。中子散射測量已將~1THz的光譜特征與β-桶狀蛋白GFP二級結構的集體運動直接聯系起來。二級結構中的氫鍵模式可能是明顯扭曲的，這使得二級結構的自動測定變得困難。有幾種正式定義蛋白質二級結構的方法（如：DSSP、DEFINE、STRIDE、ScrewFit、SST）。

蛋白質二級結構詞典，簡稱DSSP，常用單字母代碼來描述蛋白質二級結構。二級結構是根據Pauling等人在1951年（在任何蛋白質結構被實驗確定之前）最初提出的氫鍵模式來分配的。DSSP定義的二級結構有八種類型。G=3圈螺旋線（310螺旋線）。最小長度為3個殘基。H=4圈螺旋線（α螺旋線）。最小長度為4個殘基。

I=5圈螺旋（π螺旋）。最小長度為5個殘基。T=氫鍵圈（3、4或5圈）E=平行和/或反平行的β-片狀結構的延伸鏈。最小長度為2個殘基。B=孤立的β橋中的殘基（單對β-sheet氫鍵的形成）S=彎曲（xxx非基于氫鍵的分配）。C=螺旋（不在上述任何構象中的殘基）。"螺旋"通常被編碼為''（空格）、C（螺旋）或'-'（破折號）。螺旋（G、H和I）和片狀構象都需要有一個合理的長度。這意味著一級結構中2個相鄰的殘基必須形成相同的氫鍵模式。如果螺旋或片狀氫鍵模式太短，它們將被分別指定為T或B。還存在其他的蛋白質二級結構分配類別（急轉彎、歐米茄環等），但它們使用的頻率較低。二級結構是由氫鍵定義的，所以氫鍵的確切定義是至關重要的。二級結構的標準氫鍵定義是DSSP的定義。