• 基因文庫

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    基因文庫

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    分子生物學中,庫是一個DNA片段的集合,通過分子克隆的過程在微生物群體中儲存和繁殖。有不同類型的DNA文庫,包括cDNA文庫(由反轉錄的RNA形成)、基因組文庫(由基因組DNA形成)和隨機突變體文庫(由加入替代核苷酸或密碼子的新基因合成形成)。DNA文庫技術是目前分子生物學、基因工程蛋白質工程的主流,這些文庫的應用取決于原始DNA片段來源。克隆載體和文庫制備技術存在差異,但一般來說,每個DNA片段都被xxx地插入到克隆載體中,然后將重組DNA分子庫轉移到細菌(細菌人工染色體或BAC庫)或酵母的群體中,這樣每個生物體平均包含一個構建體(載體+插入物)。隨著生物群的培養,其中包含的DNA分子被復制和繁殖(因此被克隆)。

    術語

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    可以指一個生物群體,其中每個生物都攜帶一個插入克隆載體的DNA分子,或者指所有克隆載體分子的集合。

    cDNA庫

    cDNA庫代表了從一個特定的來源(可以是一個細胞集合,一個特定的組織,或整個生物體)通過使用逆轉錄酶將其轉換回DNA模板而純化的mRNA樣本。因此,它代表了在mRNA純化時的生理、發育或環境條件下,在該特定來源中被積極轉錄的基因。cDNA文庫可以使用促進全長克隆的技術或在產生用于識別表達序列標簽的較短片段的條件下生成。

    cDNA文庫在逆向遺傳學中很有用,但它們只占特定生物體整體基因組的非常小的一部分(小于1%)。

    cDNA庫的應用包括。

    • 發現新基因
    • 克隆全長cDNA分子用于體外培養。用于基因功能體外研究的全長cDNA分子
    • 研究在不同細胞或組織中表達的mRNA的復制體
    • 研究不同細胞或組織中的替代剪接

    基因組文庫

    基因組文庫是一組克隆,它們共同代表了某一生物體的整個基因組。組成基因組庫的克隆數量取決于(1)有關基因組的大小和(2)特定克隆載體系統所能容忍的插入大小。對于大多數實際目的來說,基因組DNA的組織來源并不重要,因為人體的每一個細胞幾乎都含有相同的DNA(有一些例外)。

    基因組庫的應用包括。

    • 確定特定生物體的完整基因組序列(見基因組計劃
    • 作為基因組序列的來源,通過基因工程產生轉基因動物
    • 研究體外調節序列的功能
    • 研究癌癥組織的突變

    合成突變體庫

    與上述庫類型相比。存在各種人工方法來制作突變體基因庫。整個基因的變異可以通過容易出錯的PCR、通過將相似基因的部分重組在一起的DNA洗牌或基于轉座子的方法隨機引入。另外,一個或多個基因的點突變體可以通過在自發合成或飽和誘變過程中針對特定密碼子的突變以可控的方式構建。這導致了代表原始基因變體的雙鏈DNA分子的混合。

    然后可以對這些庫中表達的蛋白質進行篩選,以獲得表現出有利特性(如穩定性、結合親和力或酶活性)的變體。這使得創建基因變體和篩選表達產物的循環可以在一個定向進化過程中重復進行。

    基因文庫

    cDNA文庫制備技術概述

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    DNA提取

    如果創建一個mRNA文庫(即用cDNA克隆),有幾種可能的方案來分離全長mRNA。要從基因組DNA(也稱為gDNA)文庫中提取DNA,DNA的miniprep可能是有用的。

    插入前的準備工作

    cDNA文庫需要注意確保mRNA的全長克隆被捕獲為cDNA(以后將被插入載體)。為此,已經設計了一些協議來優化第1條cDNA鏈和第2條cDNA鏈的合成,同時也能有針對性地克隆到載體中。

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    詞條目錄
    1. 基因文庫
    2. 術語
    3. cDNA庫
    4. 基因組文庫
    5. 合成突變體庫
    6. cDNA文庫制備技術概述
    7. DNA提取
    8. 插入前的準備工作

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