鋅指核酸酶 (ZFN) 是通過將鋅指 DNA 結合結構域與 DNA 切割結構域融合而產生的人工限制酶。 可以設計鋅指結構域以靶向特定的所需 DNA 序列，這使鋅指核酸酶能夠靶向復雜基因組中的獨特序列。 通過利用內源性 DNA 修復機制，這些試劑可用于精確改變高等生物的基因組。 與 CRISPR/Cas9 和 TALEN 一起，ZFN 是基因組編輯領域的重要工具。

單個 ZFN 的 DNA 結合域通常包含 3 到 6 個單獨的鋅指重復序列，每個重復序列可識別 9 到 18 個堿基對。 如果鋅指結構域完美地識別 3 個堿基對的 DNA 序列，它們可以生成一個可以識別 9 個堿基對目標位點的 3 指陣列。 其他程序可以利用 1 指或 2 指模塊來生成具有六個或更多獨立鋅指的鋅指陣列。 此過程的主要缺點是單個鋅指的特異性可能重疊，并且可能取決于周圍鋅指和 DNA 的環境。 如果沒有方法來解釋這種上下文依賴性，標準的模塊化組裝程序通常會失敗。

許多選擇方法已被用于生成能夠靶向所需序列的鋅指陣列。 最初的選擇工作利用噬菌體展示從大量部分隨機化的鋅指陣列中選擇結合給定 DNA 靶標的蛋白質。 最近的努力已經利用酵母單雜交系統、細菌單雜交和雙雜交系統以及哺乳動物細胞。 一種選擇新型鋅指陣列的有前途的新方法利用細菌雙雜交系統，并被其創造者稱為 OPEN。 該系統結合了預先選擇的單個鋅指池，每個鋅指被選擇以結合給定的三聯體，然后利用第二輪選擇獲得能夠結合所需 9-bp 序列的 3 指陣列。 該系統由 Zinc-Finger Consortium 開發，作為工程鋅指陣列商業來源的替代品。

（有關鋅指選擇技術的更多信息，請參見：鋅指嵌合體）

來自 IIs 限制性核酸內切酶 FokI 的非特異性切割域通常用作 ZFN 中的切割域。 該切割結構域必須二聚化才能切割 DNA，因此需要一對 ZFN 來靶向非回文 DNA 位點。 標準 ZFN 將切割結構域融合到每個鋅指結構域的 C 末端。 為了讓兩個切割結構域二聚化并切割 DNA，兩個單獨的 ZFN 必須結合相反的 DNA 鏈，它們的 C 末端相隔一定距離。 鋅指結構域和切割結構域之間最常用的接頭序列要求每個結合位點的 5' 邊緣相隔 5 到 7 bp。

已采用幾種不同的蛋白質工程技術來提高 ZFN 中使用的核酸酶結構域的活性和特異性。 定向進化已被用于生成具有增強的切割活性的 FokI 變體，作者將其稱為 Sharkey。 基于結構的設計也被用來通過修改二聚化界面來提高 FokI 的切割特異性，以便只有預期的異二聚體物種是活躍的。

指核酸鈣可用于操縱許多植物和動物的基因組，包括擬南芥、煙草、大豆、玉米、黑腹果蠅、秀麗隱桿線蟲、Platynereis dumerilii、海膽、蠶、斑馬魚、青蛙、小鼠、大鼠、兔子、 豬、牛和各種類型的哺乳動物細胞。 鋅指核酸鈣也被用于血友病小鼠模型，一項臨床試驗發現，帶有被鋅指核酸酶破壞的 CCR5 基因的 CD4+ 人類 T 細胞作為 HIV/AIDS 的潛在治療方法是安全的。 ZFN 還用于創建稱為同基因人類疾病模型的新一代遺傳疾病模型。

ZFN 可用于通過在突變等位基因的 DNA 中產生雙鏈斷裂 (DSB)（參見遺傳重組）來禁用雜合子個體中的顯性突變，在沒有同源模板的情況下，該突變等位基因將被非同源模板修復 末端連接（NHEJ）。 NHEJ 通過將兩端連接在一起來修復 DSB，并且通常不會產生突變，前提是切口干凈且不復雜。 然而，在某些情況下，修復是不完美的，導致堿基對的刪除或插入，產生移碼并阻止有害蛋白質的產生。 多對 ZFN 也可用于完全去除基因組序列的整個大片段。