等電位聚焦 (IEF)，也稱為電聚焦，是一種通過等電點 (pI) 的差異來分離不同分子的技術。 它是一種區域電泳，通常在凝膠中的蛋白質上進行，它利用了目標分子的總電荷是其周圍環境 pH 值的函數這一事實。

IEF 涉及將兩性電解質溶液添加到固定化 pH 梯度 (IPG) 凝膠中。 IPG 是與 pH 梯度共聚的丙烯酰胺凝膠基質，除了最堿性 (＞12) 的 pH 值外，它會產生完全穩定的梯度。 固定化 pH 梯度是通過固定化物比例的連續變化獲得的。 不動素是由其 pK 值定義的弱酸或弱堿。

處于低于其等電點 (pI) 的 pH 范圍內的蛋白質將帶正電，因此將向陰極（帶負電的電極）遷移。 然而，當它通過增加 pH 的梯度遷移時，蛋白質的總電荷將減少，直到蛋白質達到與其 pI 對應的 pH 區域。 此時它沒有凈電荷，因此遷移停止（因為對任一電極都沒有電吸引力）。 結果，蛋白質變得聚焦成尖銳的固定條帶，每個蛋白質位于與其 pI 對應的 pH 梯度中的一個點。 該技術能夠實現極高的分辨率，蛋白質因單個電荷而不同，被分成不同的條帶。

要聚焦的分子分布在具有 pH 梯度（通常由脂肪族兩性電解質產生）的介質中。 電流通過介質，形成正陽極和負陰極端。 帶負電的分子通過介質中的 pH 梯度向正端移動，而帶正電的分子向負端移動。 當一個粒子向與其電荷相反的極移動時，它會通過不斷變化的 pH 梯度移動，直到它到達一個點，在這個點上，該分子的 pH 值達到等電點。 此時分子不再具有凈電荷（由于相關官能團的質子化或去質子化），因此不會在凝膠內進一步進行。 通過首先對具有不同 pI 值的小分子溶液（例如聚兩性電解質）進行電泳，在添加感興趣的顆粒之前建立梯度。

該方法特別常用于蛋白質研究，蛋白質根據酸性和堿性殘基的相對含量進行分離，其值由 pI 表示。 將蛋白質引入由聚丙烯酰胺、淀粉或瓊脂糖組成的固定化 pH 梯度凝膠中，其中已建立 pH 梯度。 大孔凝膠通常用于此過程，以消除任何篩分效應，或由不同大小的蛋白質的不同遷移率引起的 pI 中的偽影。 等位聚焦可以分辨 pI 值差異小至 0.01 的蛋白質。 等電位聚焦是二維凝膠電泳的xxx步，首先通過pI值分離蛋白質，然后通過SDS-PAGE進一步根據分子量分離。

根據一些觀點，活的真核細胞在其內部進行蛋白質的等電聚焦，以克服酶及其反應物擴散對代謝反應速率的限制，并調節特定生化過程的速率。 通過將特定代謝途徑的酶集中到其內部不同的小區域，細胞可以將特定生化途徑的速率提高幾個數量級。 通過例如磷酸化或去磷酸化改變酶分子的等電點 (pI)，細胞可以在其內部的不同部分之間轉移酶分子，以開啟或關閉特定的生化過程。

基于微芯片的電泳是毛細管電泳的一種有前途的替代方法，因為它有可能提供快速蛋白質分析、與其他微流體單元操作的直接集成、全通道檢測、硝酸纖維素膜、更小的樣本量和更低的制造成本。

對更快、更易于使用的蛋白質分離工具的需求增加，加速了 IEF 向溶液內分離的發展。 在這種情況下，開發了一種多結 IEF 系統來執行快速且無凝膠的 IEF 分離。 多接頭 IEF 系統使用一系列容器，毛細管穿過每個容器。 每個容器中的部分毛細管被半透膜代替。 容器包含具有不同 pH 值的緩沖溶液，以便在毛細管內有效地建立 pH 梯度。