基因敲除（縮寫：KO）是一種遺傳技術，其中使生物體的一個基因失效（從生物體中敲除）。 然而，KO也可以指被敲除的基因或攜帶基因敲除的生物體。 基因敲除生物或簡單的基因敲除用于研究基因功能，通常是通過研究基因丟失的影響。 研究人員通過基因敲除生物體與正常個體的差異進行推論。

KO 技術本質上與基因敲入相反。 在生物體中同時敲除兩個基因被稱為雙敲除 (DKO)。 類似地，術語三重敲除 (TKO) 和四重敲除 (QKO) 分別用于描述三個或四個被敲除的基因。 然而，需要區分雜合子和純合子 KO。 在前者中，兩個基因拷貝（等位基因）中只有一個被敲除，在后者中兩個都被敲除。

敲除是通過多種技術完成的。 最初，確定了自然發生的突變，然后必須通過 DNA 測序或其他方法確定基因丟失或失活。

傳統上，同源重組是導致基因敲除的主要方法。 該方法涉及創建包含所需突變的 DNA 構建體。 出于敲除目的，這通常涉及用耐藥標記代替所需的敲除基因。 該構建體還將包含與目標序列至少 2kb 的同源性。 可以通過顯微注射或電穿孔將構建體遞送至干細胞。 然后，該方法依靠細胞自身的修復機制將 DNA 結構重組為現有 DNA。 這導致基因的序列被改變，并且大多數情況下基因將被翻譯成無功能的蛋白質，如果它被翻譯的話。 然而，這是一個低效的過程，因為同源重組僅占 DNA 整合的 10-2 到 10-3。 通常，構建體上的藥物選擇標記用于選擇發生重組事件的細胞。

這些現在缺乏該基因的干細胞可以在體內使用，例如在小鼠中，方法是將它們插入早期胚胎。 如果由此產生的嵌合小鼠在其種系中包含遺傳變化，則可以將其傳遞給后代。

在大多數基因包含兩個等位基因的二倍體生物體中，還可能包含幾個以相同角色協作的相關基因，進行額外輪次的轉化和選擇，直到每個目標基因都被敲除。 可能需要選擇性育種來產生純合基因敲除動物。

目前使用三種方法涉及精確定位 DNA 序列以引入雙鏈斷裂。 一旦發生這種情況，細胞的修復機制將嘗試修復這種雙鏈斷裂，通常是通過非同源末端連接 (NHEJ)，這涉及將兩個切割末端直接連接在一起。 這可能做得不完美，因此有時會導致堿基對的插入或缺失，從而導致移碼突變。 這些突變可以使它們所在的基因失去功能，從而產生該基因的敲除。 這個過程比同源重組更有效，因此可以更容易地用于創建雙等位基因敲除。

鋅指核酸酶由可以精確靶向 DNA 序列的 DNA 結合域組成。 每個鋅指都可以識別所需 DNA 序列的密碼子，因此可以模塊化組裝以與特定序列結合。 這些結合域與限制性核酸內切酶偶聯，可導致 DNA 中的雙鏈斷裂 (DSB)。 修復過程可能會引入破壞基因功能的突變。

轉錄激活因子樣效應核酸酶 (TALEN) 也包含一個 DNA 結合域和一個可以切割 DNA 的核酸酶。 DNA 結合區由氨基酸重復組成，每個氨基酸重復識別所需目標 DNA 序列的單個堿基對。

如果這種切割針對基因編碼區，并且 NHEJ 介導的修復引入了插入和缺失，則通常會導致移碼突變，從而破壞基因的功能。

成簇規律間隔的短回文重復序列 (CRISPR)/Cas9 是一種基因組編輯方法，其中包含與 Cas9 蛋白復合的指導 RNA。 指導 RNA 可以通過簡單的互補堿基配對來設計以匹配所需的 DNA 序列，這與鋅指或 TALEN 所需的耗時的構建體組裝相反。 偶聯的 Cas9 將導致 DNA 雙鏈斷裂。