CDNA 文庫是插入宿主細胞集合中的克隆 cDNA（互補 DNA）片段的組合，構成生物體轉錄組的一部分，并作為文庫存儲。 cDNA 是由細胞核中發現的完全轉錄的 mRNA 產生的，因此僅包含生物體的表達基因。 同樣，可以生成組織特異性 cDNA 文庫。 在真核細胞中，成熟的 mRNA 已經被剪接，因此產生的 cDNA 沒有內含子，可以很容易地在細菌細胞中表達。 雖然 cDNA 文庫中的信息是一種強大而有用的工具，因為基因產物很容易識別，但文庫缺乏有關增強子、內含子和基因組 DNA 文庫中發現的其他調控元件的信息。

cDNA 是使用逆轉錄酶從真核細胞的成熟 mRNA 創建的。 在真核生物中，poly-(A) 尾巴（由長序列的腺嘌呤核苷酸組成）將 mRNA 與 tRNA 和 rRNA 區分開來，因此可用作逆轉錄的引物位點。 這有一個問題，即并非所有的轉錄本，例如組蛋白的轉錄本，都編碼 poly-A 尾巴。

首先，需要分離 mRNA 模板以創建 cDNA 文庫。 由于 mRNA 僅包含外顯子，因此應考慮分離的 mRNA 的完整性，以便仍然可以生產編碼的蛋白質。 分離的 mRNA 應在 500 bp 到 8 kb 之間。 存在幾種純化 RNA 的方法，例如三唑提取和柱純化。 可以使用寡聚 dT 核苷酸包被樹脂進行柱純化，并且可以利用 mRNA 的特征，例如具有 poly-A 尾巴，其中只有包含該特征的 mRNA 序列才會結合。 然后洗脫與柱結合的所需 mRNA。

一旦 mRNA 被純化，oligo-dT 引物（脫氧胸苷核苷酸的短序列）就會與 RNA 的 poly-A 尾巴結合。 需要引物來啟動逆轉錄酶的 DNA 合成。 這導致了 RNA-DNA 雜交體的產生，其中互補 DNA 的單鏈與 mRNA 鏈結合。 為了去除 mRNA，使用 RNAse H 酶切割 mRNA 的骨架并產生游離的 3'-OH 基團，這對于用 DNA 替換 mRNA 很重要。 然后加入 DNA 聚合酶 I，裂解的 RNA 作為引物，DNA 聚合酶 I 可以識別并啟動 RNA 核苷酸與 DNA 核苷酸的替換。 這是由 sscDNA 本身通過在 3' 端盤繞自身提供的，產生發夾環。 聚合酶延伸3'-OH端，隨后3'端環在S1核酸酶的剪切作用下打開。 然后使用限制性核酸內切酶和 DNA 連接酶將序列克隆到細菌質粒中。

然后選擇克隆的細菌，通常是通過使用抗生素選擇。 一旦被選中，就會創建細菌種群，隨后可以對其進行培養和測序以編譯 CDNA 文庫。

在復制真核基因組時通常使用 cDNA 文庫，因為信息量會減少以從文庫中移除大量非編碼區域。 cDNA 文庫用于在原核生物中表達真核基因。 原核生物的 DNA 中沒有內含子，因此不具備任何可以在轉錄過程中將其切除的酶。 cDNA沒有內含子，因此可以在原核細胞中表達。 cDNA 文庫在反向遺傳學中最有用，在這種情況下，額外的基因組信息用處不大。 此外，cDNA 文庫經常用于功能性克隆，以根據編碼蛋白質的功能識別基因。 在研究真核 DNA 時，表達文庫是使用互補 DNA (cDNA) 構建的，以幫助確保插入片段是真正的基因。

CDNA 文庫缺乏基因組 DNA 中的非編碼和調控元件。 基因組 DNA 文庫提供了有關生物體的更多詳細信息，但生成和保存需要更多資源。

可以使用限制性位點接頭克隆 cDNA 分子。 接頭是短的雙鏈 DNA（寡脫氧核糖核苷酸）片段，長約 8 至 12 個核苷酸對，包括限制性核酸內切酶切割位點，例如 BamHI。 cDNA 和接頭都有平端，可以使用高濃度的 T4 DNA 連接酶將其連接在一起。 然后通過用適當的核酸內切酶切割 cDNA 末端（現在具有帶有摻入位點的接頭），在 cDNA 分子中產生粘性末端。 然后克隆載體（質粒）也被適當的核酸內切酶切割。 在將插入物的粘性末端連接到載體中之后，將所得的重組 DNA 分子轉移到大腸桿菌宿主細胞中進行克隆。