DNA 連接酶是一種特殊類型的酶，一種連接酶 (EC 6.5.1.1)，它通過催化磷酸二酯鍵的形成來促進 DNA 鏈的連接。 它在修復生物體雙鏈 DNA 中的單鏈斷裂方面發揮作用，但某些形式（如 DNA 連接酶 IV）可能專門修復雙鏈斷裂（即 DNA 兩條互補鏈的斷裂）。 單鏈斷裂由 DNA 連接酶修復，使用雙螺旋的互補鏈作為模板，DNA 連接酶產生最終的磷酸二酯鍵以完全修復 DNA。

DNA 連接酶用于 DNA 修復和 DNA 復制（參見哺乳動物連接酶）。 此外，DNA 連接酶在分子生物學實驗室中廣泛用于重組 DNA 實驗（參見研究應用）。 純化的 DNA 連接酶用于基因克隆，將 DNA 分子連接在一起形成重組 DNA。

DNA連接酶的機制是在一個核苷酸（受體）的3'羥基末端與另一個核苷酸（供體）的5'磷酸末端之間形成兩個共價磷酸二酯鍵。 每個形成的磷酸二酯鍵消耗兩個 ATP 分子。 連接酶反應需要 AMP，該反應分四個步驟進行：

• 活性位點的重組，如DNA片段中的缺口或岡崎片段等。
• 酶活性中心賴氨酸殘基的腺苷酸化（AMP 加成），釋放出焦磷酸鹽；
• 將 AMP 轉移到所謂供體的 5' 磷酸，形成焦磷酸鍵；
• 在供體的 5' 磷酸和受體的 3' 羥基之間形成磷酸二酯鍵。

連接酶也適用于平端，但需要更高的酶濃度和不同的反應條件。

大腸桿菌 DNA 連接酶由 lig 基因編碼。 大腸桿菌以及大多數原核生物中的 DNA 連接酶使用通過裂解煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 獲得的能量來產生磷酸二酯鍵。 它不連接平端 DNA，除非在聚乙二醇分子擁擠的條件下，并且不能有效地將 RNA 連接到 DNA。

適當濃度的 DNA 聚合酶可增強大腸桿菌 DNA 連接酶的活性。 只有當 DNA 聚合酶 1 的濃度遠低于要連接的 DNA 片段時，增強才會起作用。 當 Pol I DNA 聚合酶的濃度較高時，它對大腸桿菌 DNA 連接酶有不利影響

來自噬菌體 T4（一種感染大腸桿菌的噬菌體）的 DNA 連接酶。 T4 連接酶是實驗室研究中最常用的連接酶。 它可以連接 DNA、寡核苷酸以及 RNA 和 RNA-DNA 雜交體的粘性末端或平末端，但不能連接單鏈核酸。 它還可以比大腸桿菌 DNA 連接酶更有效地連接平端 DNA。 與大腸桿菌 DNA 連接酶不同，T4 DNA 連接酶不能利用 NAD，它xxx需要 ATP 作為輔助因子。 已經進行了一些工程來提高 T4 DNA 連接酶的體外活性； 例如，一種成功的方法測試了與幾種替代 DNA 結合蛋白融合的 T4 DNA 連接酶，發現以 p50 或 NF-kB 作為融合伙伴的構建體在用于克隆目的的平端連接中的活性比野生的高 160% 以上 T4 型 DNA 連接酶。 將片段插入質粒載體的典型反應將使用約 0.01（粘性末端）至 1（平末端）單位的連接酶。 T4 DNA 連接酶的最佳孵育溫度為 16 °C。

噬菌體 T4 連接酶突變體對紫外線照射和烷化劑甲磺酸甲酯的敏感性增加，表明 DNA 連接酶用于修復由這些試劑引起的 DNA 損傷。

在哺乳動物中，有四種特定類型的連接酶。

• DNA 連接酶 I：在核糖核酸酶 H 從岡崎片段中去除 RNA 引物后，連接滯后鏈的新生 DNA。
• DNA 連接酶 III：與 DNA 修復蛋白 XRCC1 形成復合物，有助于在核苷酸切除修復和重組片段過程中密封 DNA。 在所有已知的哺乳動物 DNA 連接酶中，只有 Lig III 被發現存在于線粒體中。

• DNA連接酶IV：與XRCC4復合。 它催化非同源末端連接 DNA 雙鏈斷裂修復途徑的最后一步。 它也是 V(D)J 重組所必需的，V(D)J 重組是在免疫系統發育過程中產生免疫球蛋白和 T 細胞受體位點多樣性的過程。

• DNA 連接酶 II：由 DNA 連接酶 III 的蛋白水解降解產生的純化產物。 最初，它被認為是另一種 DNA 連接酶，這也是 DNA 連接酶不尋常命名的原因。

來自真核生物和一些微生物的 DNA 連接酶使用三磷酸腺苷 (ATP) 而不是 NAD。