熒光原位雜交

熒光原位雜交 (FISH) 是一種分子細胞遺傳學技術，它使用熒光探針僅結合具有高度序列互補性的核酸序列的特定部分。 它由生物醫學研究人員在 80 年代初期開發，用于檢測和定位染色體上特定 DNA 序列的存在與否。 熒光顯微鏡可用于找出熒光探針與染色體結合的位置。 FISH 通常用于尋找 DNA 中的特定特征，用于遺傳咨詢、醫學和物種鑒定。 FISH 還可用于檢測和定位細胞、循環腫瘤細胞和組織樣本中的特定 RNA 靶標（mRNA、lncRNA 和 miRNA）。 在這種情況下，它可以幫助定義細胞和組織內基因表達的時空模式。

在生物學中，探針是與感興趣的核苷酸序列互補的單鏈 DNA 或 RNA。

可以針對任何基因或基因內的任何序列設計 RNA 探針，以可視化組織和細胞中的 mRNA、lncRNA 和 miRNA。 FISH 用于檢查細胞繁殖周期，特別是細胞核間期是否存在任何染色體異常。 FISH 允許分析大量檔案案例，通過創建具有吸引相似染色體的人工染色體基礎的探針，更容易識別精確定位的染色體。 當檢測到核酸異常時，每個探針的雜交信號。 每個用于檢測 mRNA 和 lncRNA 的探針由約 20-50 個寡核苷酸對組成，每對覆蓋 40-50 bp 的空間。 具體細節取決于所使用的特定 FISH 技術。 對于 miRNA 檢測，探針使用專有化學方法對 miRNA 進行特異性檢測，并覆蓋整個 miRNA 序列。

探針通常源自分離、純化和擴增用于人類基因組計劃的 DNA 片段。 與可以直接測序的長度相比，人類基因組的大小是如此之大，以至于有必要將基因組分成片段。為了保存片段及其各自的 DNA 序列，將片段添加到一個不斷復制細菌種群的系統中。 細菌的克隆種群，每個種群都保持一條人工染色體，儲存在世界各地的各個實驗室中。 可以在任何包含文庫的實驗室中培養、提取和標記人工染色體 (BAC)。 基因組文庫通常以開發它們的機構命名。這些片段大約有 10 萬個堿基對，是大多數 FISH 探針的基礎。

使用 RNA FISH 的目的是檢測細胞、組織切片甚至整片中的目標 mRNA 轉錄本。 該過程分為 3 個主要步驟：組織制備（雜交前）、雜交和洗滌（雜交后）。

組織制備首先收集適當的組織切片以進行 RNA FISH。 首先，固定細胞、循環腫瘤細胞 (CTC)、福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 或冷凍組織切片。 一些常用的固定劑是磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中的 4% 甲醛或多聚甲醛 (PFA)。 FISH 也已在未固定的細胞上成功完成。 固定后，樣品被透化以允許雜交試劑滲透。

雜交過程必須具備所有最佳條件才能獲得成功的原位結果，包括溫度、pH、鹽濃度和雜交反應時間。 檢查所有必要條件后，可以開始雜交步驟，首先添加一個由 20 個寡核苷酸對組成的目標特異性探針，與目標 RNA 雜交。 獨立但兼容的信號放大系統支持多重檢測（每次檢測最多兩個靶標）。 信號放大是通過一系列順序雜交步驟實現的。