發酵母菌雙雜合系統（最初稱為酵母雙雜交系統或 Y2H）是一種分子生物學技術，用于通過測試兩者之間的物理相互作用（例如結合）來發現蛋白質-蛋白質相互作用 (PPI) 和蛋白質-DNA 相互作用 蛋白質或單個蛋白質和 DNA 分子，分別。

測試背后的前提是通過轉錄因子與上游激活序列 (UAS) 的結合來激活下游報告基因。 對于雙雜交篩選，轉錄因子被分成兩個獨立的片段，稱為 DNA 結合域（DBD 或通常也縮寫為 BD）和激活域 (AD)。 BD 是負責綁定到 UAS 的域，AD 是負責轉錄激活的域。 因此，Y2H 是一種蛋白質片段互補測定。

該技術由 Stanley Fields 和 Ok-Kyu Song 于 1989 年xxx，最初設計用于使用釀酒酵母的 Gal4 轉錄激活因子檢測蛋白質-蛋白質相互作用。 Gal4 蛋白激活參與半乳糖利用的基因的轉錄，這構成了選擇的基礎。 從那時起，相同的原理被用于描述許多替代方法，包括一些檢測蛋白質-DNA 相互作用或 DNA-DNA 相互作用的方法，以及使用不同宿主生物（如大腸桿菌或哺乳動物細胞而不是酵母）的方法。

雙雜交篩選的關鍵在于，在大多數真核轉錄因子中，激活域和結合域是模塊化的，并且可以在彼此接近的情況下發揮作用而無需直接結合。 這意味著即使轉錄因子被分裂成兩個片段，當兩個片段間接連接時它仍然可以激活轉錄。

最常見的篩選方法是酵母雙雜交試驗。 在這種方法中，研究人員知道每個獵物在所用培養基（瓊脂平板）上的位置。 在最近十年中，使用高通量篩選系統（通常使用機器人）篩選了數百萬種生物體中的潛在相互作用，并且已經檢測到數以千計的相互作用并在數據庫中歸類為 BioGRID。 該系統通常使用基因工程酵母菌株，其中缺乏某些營養素（通常是氨基酸或核酸）的生物合成。 當在缺乏這些營養素的培養基上生長時，酵母無法存活。 可以使這種突變酵母菌株摻入質粒形式的外源 DNA。 在酵母雙雜交篩選中，將單獨的誘餌和獵物質粒同時引入突變酵母菌株或使用交配策略在一個宿主細胞中獲得兩種質粒。

第二種高通量方法是文庫篩選方法。 在這個設置中，誘餌和獵物窩藏細胞以隨機順序交配。 在選擇性培養基上交配和選擇存活細胞后，科學家將對分離的質粒進行測序，以查看哪個獵物（DNA 序列）與使用的誘餌相互作用。 與矩陣方法相比，這種方法的重現率較低，并且往往會產生更多的誤報。

質粒被改造以產生一種蛋白質產物，其中 DNA 結合域 (BD) 片段融合到一種蛋白質上，而另一種質粒被改造以產生一種蛋白質產物，其中激活域 (AD) 片段融合到另一種蛋白質上。 與 BD 融合的蛋白質可稱為誘餌蛋白，通常是研究人員用來識別新結合伙伴的已知蛋白質。 與 AD 融合的蛋白質可稱為獵物蛋白，可以是單一的已知蛋白質，也可以是已知或未知蛋白質的文庫。 在這種情況下，文庫可能由代表特定生物體或組織中表達的所有蛋白質的蛋白質編碼序列的集合組成，或者可能通過合成隨機 DNA 序列生成。

無論來源如何，它們隨后都被整合到質粒的蛋白質編碼序列中，然后將質粒轉染到選擇用于篩選方法的細胞中。 當使用文庫時，該技術假定每個細胞只用一個質粒轉染，因此每個細胞最終只表達蛋白質文庫中的一個成員。

如果誘餌和獵物蛋白相互作用（即結合），則轉錄因子的 AD 和 BD 間接連接，使 AD 接近轉錄起始位點，報告基因的轉錄就會發生。 如果這兩種蛋白質不相互作用，報告基因就不會轉錄。 這樣，融合蛋白之間的成功相互作用與細胞表型的變化有關。