4Pi顯微鏡是一種具有改進的軸向分辨率的激光掃描熒光顯微鏡。 有了它，軸向分辨率的典型范圍 500-700 nm 可以提高到 100-150 nm，這對應于一個幾乎球形的焦斑，其體積比標準共聚焦顯微鏡小 5-7 倍。

分辨率的提高是通過使用兩個相對的物鏡實現的，它們都聚焦在相同的幾何位置。 此外，通過兩個物鏡中的每一個的光程長度差異都經過仔細對齊，以達到最小。 通過這種方法，駐留在兩個物鏡的共同焦點區域中的分子可以從兩側被相干地照亮，并且反射或發射的光也可以被相干地收集，即發射光在檢測器上的相干疊加是可能的。 用于照明和檢測的立體角 Ω {\displaystyle \Omega } 增加并接近其xxx值。 在這種情況下，樣品會同時從所有側面被照射和檢測。

4Pi顯微鏡的工作模式如圖所示。 激光由分束器分開，并由反射鏡引導至兩個相對的物鏡。 在兩個聚焦光束的共同焦點處發生疊加。 這個位置的激發分子發出熒光，熒光由兩個物鏡收集，由同一個分束器組合并由二向色鏡偏轉到檢測器上。 兩個發射光路的疊加可以再次發生。

在理想情況下，每個物鏡都可以從 Ω = 2 π {\displaystyle \Omega =2\pi } 的立體角收集光線。 使用兩個物鏡，可以從各個方向收集（立體角 Ω = 4 π {\displaystyle \Omega =4\pi } ）。 這種顯微鏡的名稱來源于激發和檢測的xxx可能立體角。 實際上，物鏡的孔徑角只能達到約 140°，對應于 Ω ≈ 1.3 π {\displaystyle \Omega \approx 1.3\pi } 。

顯微鏡可以三種不同的方式操作：在 A 型 4Pi 顯微鏡中，激發光的相干疊加用于產生更高的分辨率。 發射光要么僅從一側檢測到，要么從兩側檢測到非相干疊加。 在 B 型 4Pi 顯微鏡中，只有發射光會產生干擾。 當在 C 型模式下操作時，激發光和發射光都被允許干涉，從而導致盡可能高的分辨率增加（與共聚焦顯微鏡相比，沿著光軸約 7 倍）。

在真正的 4Pi 顯微鏡中，光不能均勻地從所有方向應用或收集，從而導致點擴散函數中出現所謂的旁瓣。 通常（但不總是）雙光子激發顯微鏡在 4Pi 顯微鏡中與發射針孔結合使用，以將這些旁瓣降低到可容忍的水平。

1971 年，Christoph Cremer 和 Thomas Cremer 提議創建一個完美的全息圖，即攜帶點源在各個方向發射的整個場信息的全息圖，即所謂的 4 π {\displaystyle 4\pi } 全息圖。 然而，1978 年的出版物得出了一個不正確的物理結論（即點狀光斑），并且完全忽略了軸向分辨率增加是增加立體角另一側的實際好處。 Stefan Hell 于 1991 年發明了 4Pi 顯微鏡實用系統的xxx個描述，即具有兩個相對的干涉透鏡的裝置。他在 1994 年通過實驗證明了它。

在接下來的幾年里，這種顯微鏡的應用數量不斷增加。 例如，樣品中 64 個點的平行激發和檢測同時結合改進的空間分辨率，導致 2002 年用 4Pi 顯微鏡成功記錄了酵母細胞中線粒體的動態。

顯微鏡制造商 Leica Microsystems 推出了商業版本 2004 年，后來停產。

到目前為止，4Pi 顯微鏡的最佳質量是結合受激發射耗盡 (STED) 原理等超分辨率技術實現的。 使用具有適當激發和去激發光束的 4Pi 顯微鏡，可以創建一個統一的 50 nm 大小的光斑，這對應于與共聚焦顯微鏡相比，固定細胞中聚焦體積減小了 150-200 倍。 通過將 4Pi 顯微鏡和具有可切換蛋白質的 RESOLFT 顯微鏡相結合，現在可以在低光照水平下以低于 40 nm 的各向同性分辨率拍攝活細胞圖像。