全內反射熒光顯微鏡 (TIRFM) 是一種顯微鏡，可以觀察樣品的薄區域，通常小于 200 納米。

TIRFM 是一種成像模式，它在載玻片上支撐的薄光學樣品切片中使用熒光細胞的激發。 該技術基于以下原理：當激發光在透明固體蓋玻片與液體介質的界面處發生全內反射時，在固-液界面處會產生電磁場，也稱為倏逝波 頻率作為激發光。 漸逝波的強度隨與固體表面的距離呈指數衰減，因此只有在固體的幾百納米范圍內的熒光分子才能被有效激發。 然后可以獲得熒光的二維圖像，盡管也有一些機制可以獲得關于囊泡或結構在細胞中的位置的三維信息。

寬場熒光于 1910 年推出，這是一種光學技術，可以照亮整個樣品，如圖 1 所示。隨后，共聚焦顯微鏡于 1960 年推出，它通過將光導向精確點并照亮光錐來減少樣品的背景和曝光時間 進入樣本。 在 20 世紀 80 年代，TIRFM 的引入通過僅照亮被檢查樣品的薄部分進一步減少了背景和曝光時間。

有兩種常見的方法可以為 TIRFM 產生倏逝波。 xxx種是棱鏡方法，它使用棱鏡以足以引起全內反射的入射角將激光引向蓋玻片和介質/細胞之間的界面。 這種配置已應用于細胞顯微鏡 30 多年，但由于一些限制從未成為主流工具。 盡管棱鏡配置有許多變化，但大多數都限制了對標本的訪問，這使得難以執行操作、將介質注入標本空間或進行生理測量。 另一個缺點是，在大多數基于倒置顯微鏡設計的配置中，照明是在物鏡光學元件相對的樣品側引入的，這需要通過大量樣品對消逝場區域進行成像。 對這個系統進行成像需要很大的復雜性和精確性，這意味著棱鏡方法并沒有被許多生物學家使用，而是僅限于物理學家使用。

另一種方法被稱為物鏡法，它增加了 TIRFM 在細胞顯微鏡中的使用，并且自商業解決方案可用以來進一步增加。 在這種機制中，通過改變物鏡后焦平面上光束焦點的離軸位置，可以輕松地在標準寬場熒光和 TIRF 之間切換。 有幾種開發的方法可以改變光束的位置，例如使用可以改變與連接到顯微鏡的熒光照明器相關的位置的致動器。

在細胞和分子生物學中，已經使用傳統熒光顯微鏡研究了細胞表面的大量分子事件，例如細胞粘附、激素對細胞的結合、神經遞質的分泌和膜動力學。 然而，與樣品表面結合的熒光團和周圍介質中的熒光團以平衡狀態存在。 當這些分子被激發并用傳統的熒光顯微鏡檢測時，由于非結合分子的數量要多得多，結合到表面的那些熒光團產生的熒光通常會被背景熒光淹沒。 TIRFM 允許選擇性激發表面結合的熒光團，而未結合的分子不會被激發，也不會發出熒光。 由于亞微米表面選擇性，TIRFM 已成為單分子檢測的首選方法。

TIRFM 在細胞顯微鏡中有許多應用。 其中一些應用程序包括：

• 測量響應配體結合和受體運動的受體內吞作用的動力學
• 通過用熒光染料加載經歷胞吐作用的囊泡來觀察胞吐事件
• 定性和定量地描述不同蛋白質在胞吐/胞吞中的作用
• 觀察細胞與固體基質之間接觸區域的大小、運動和距離

由于能夠光學解析單個囊泡并直接跟蹤它們相互作用的動力學，TIRFM 提供了以某種方式研究參與神經生物學過程的大量蛋白質的能力。