分子克隆是分子生物學中的一套實驗方法，用于組裝重組 DNA 分子并指導它們在宿主生物體內的復制。 克隆一詞的使用是指該方法涉及復制一個分子以產生具有相同 DNA 分子的細胞群。 分子克隆通常使用來自兩種不同生物的 DNA 序列：作為要克隆 DNA 來源的物種，以及將作為重組 DNA 復制的活宿主的物種。 分子克隆方法是現代生物學和醫學的許多當代領域的核心。

在傳統的分子克隆實驗中，要克隆的 DNA 從感興趣的生物體中獲得，然后在試管中用酶處理以產生更小的 DNA 片段。 隨后，將這些片段與載體 DNA 結合，生成重組 DNA 分子。 然后將重組 DNA 引入宿主生物體（通常是易于生長的良性實驗室大腸桿菌菌株）。 這將產生一個生物體群體，其中重組 DNA 分子與宿主 DNA 一起復制。 因為它們含有外源 DNA 片段，所以它們是轉基因或轉基因微生物 (GMO)。 這個過程利用了這樣一個事實，即可以誘導單個細菌細胞吸收并復制單個重組 DNA 分子。 然后這個單細胞可以呈指數增長，產生大量細菌，每個細菌都含有原始重組分子的拷貝。 因此，由此產生的細菌種群和重組 DNA 分子通常都稱為克隆。 嚴格地說，重組DNA是指DNA分子，而分子克隆是指將它們組裝起來的實驗方法。 出現了這樣的想法，即可以將不同的 DNA 序列插入質粒中，并且這些外來序列將被攜帶到細菌中并作為質粒的一部分被消化。 也就是說，這些質粒可以作為攜帶基因的克隆載體。

事實上，任何 DNA 序列都可以被克隆和擴增，但有一些因素可能會限制該過程的成功。 難以克隆的 DNA 序列的例子有反向重復序列、復制起點、著絲粒和端粒。 插入大尺寸 DNA 序列時，成功的機會也較低。 大于 10kbp 的插入成功率非常有限，但可以修改噬菌體（例如噬菌體 λ）以成功插入長達 40kbp 的序列。

在 1970 年代之前，由于無法從復雜生物體中分離和研究單個基因，對遺傳學和分子生物學的理解受到嚴重阻礙。 隨著分子克隆方法的出現，這種情況發生了巨大變化。 微生物學家試圖了解細菌限制噬菌體生長的分子機制，分離出限制性核酸內切酶，這種酶只有在遇到特定的 DNA 序列時才能切割 DNA 分子。 他們表明，限制酶在特定位置切割染色體長度的 DNA 分子，并且較大分子的特定部分可以通過大小分級分離來純化。 使用第二種酶，即 DNA 連接酶，可以將限制酶產生的片段連接成新的組合，稱為重組 DNA。 通過將感興趣的 DNA 片段與在細菌內自然復制的載體 DNA（例如噬菌體或質粒）重組，可以在細菌培養物中產生大量純化的重組 DNA 分子。 1972 年產生并研究了xxx個重組 DNA 分子。

分子克隆利用了 DNA 的化學結構在所有生物體中基本相同的事實。 因此，如果將來自任何生物體的任何 DNA 片段插入包含 DNA 復制所需分子序列的 DNA 片段，并將所得重組 DNA 引入從中獲得復制序列的生物體中，則外來 DNA 將被復制 以及轉基因生物中宿主細胞的 DNA。

分子克隆類似于聚合酶鏈反應 (PCR)，因為它允許復制 DNA 序列。 這兩種方法的根本區別在于，分子克隆涉及在活微生物中復制 DNA，而 PCR 是在不含活細胞的體外溶液中復制 DNA。

在實驗室進行實際的克隆實驗之前，大多數克隆實驗都是在計算機上使用專門的軟件進行計劃的。 雖然克隆的詳細計劃可以在任何文本編輯器中完成，連同在線實用程序，例如 PCR引物設計，專用軟件就是為此目的而存在的。