分子鐘是一種技術的比喻性術語，它使用生物分子的突變率來推斷史前時期兩種或多種生命形式發生分歧的時間。 用于此類計算的生物分子數據通常是 DNA、RNA 的核苷酸序列或蛋白質的氨基酸序列。 確定突變率的基準通常是化石或考古日期。 分子鐘于 1962 年首次在各種動物的血紅蛋白變體上進行測試，通常用于分子進化以估計物種形成或輻射的時間。 它有時被稱為基因時鐘或進化時鐘。

所謂分子鐘存在的概念首先歸因于 émile Zuckerkandl 和 Linus Pauling，他們在 1962 年注意到，根據化石證據估計，不同譜系之間血紅蛋白中氨基酸差異的數量隨時間大致呈線性變化 . 他們將這一觀察結果概括為斷言，任何特定蛋白質的進化變化率隨時間和不同譜系大致恒定（稱為分子鐘假說）。

Emanuel Margoliash 于 1963 年首次注意到遺傳等距離現象，他寫道： 似乎任何兩個物種的細胞色素 c 之間的殘基差異數量主要取決于自導致這兩個物種最初分化的進化線以來經過的時間 . 如果這是正確的，那么所有哺乳動物的細胞色素 c 應該與所有鳥類的細胞色素 c 同樣不同。 由于魚類比鳥類或哺乳動物更早地從脊椎動物進化的主干中分離出來，因此哺乳動物和鳥類的細胞色素 c 應該與魚類的細胞色素 c 同樣不同。 同樣，所有脊椎動物細胞色素 c 都應該與酵母蛋白有相同的差異。 例如，鯉魚與青蛙、烏龜、雞、兔子和馬的細胞色素 c 之間的差異恒定在 13% 到 14%。 同樣，細菌與酵母、小麥、蛾、金槍魚、鴿子和馬的細胞色素 c 之間的差異范圍為 64% 至 69%。 與 Emile Zuckerkandl 和 Linus Pauling 的工作一起，遺傳等距離結果直接導致了 1960 年代早期分子鐘假說的正式假設。

同樣，Vincent Sarich 和 Allan Wilson 在 1967 年證明，現代靈長類動物之間白蛋白的分子差異表明，在他們評估的所有譜系中都發生了大致恒定的變化率。 他們分析的基本邏輯包括認識到，如果一個物種譜系自其共同祖先以來比姐妹物種譜系進化得更快，那么外群（親緣關系更遠）的物種與進化更快的物種之間的分子差異應該更大（ 因為在該譜系上會積累更多的分子變化）而不是外群物種和進化較慢的物種之間的分子差異。 這種方法被稱為相對速率測試。 例如，Sarich 和 Wilson 的論文報告說，人類 (Homo sapiens) 和黑猩猩 (Pan troglodytes) 白蛋白免疫交叉反應表明它們與 Ceboidea（新世界猴）物種大致相同（在實驗誤差范圍內）。 這意味著自他們共同的祖先以來，他們都積累了大致相等的白蛋白變化。 在他們測試的所有靈長類動物比較中也發現了這種模式。 當用少數有據可查的化石分支點（例如在 K-T 邊界之前沒有發現現代靈長類動物化石）進行校準時，這導致 Sarich 和 Wilson 爭辯說人類與黑猩猩的分歧可能僅發生在大約 4-6 百萬年前 .

觀察類似鐘表的分子變化率最初純粹是現象學的。 后來，木村元男的工作發展了分子進化的中性理論，預測了分子鐘。 假設有 N 個個體，為了簡化計算，讓個體為單倍體（即每個基因都有一個副本）。

令新個體的中性突變率（即對適應度沒有影響的突變）為 μ {\displaystyle \mu } 。 這種新突變在種群中固定下來的概率是 1/N，因為基因的每個拷貝都和其他任何拷貝一樣好。 每一代，每個個體都可以有新的突變，因此整個種群中有 μ {\displaystyle \mu } N 個新的中性突變。 這意味著每一代，μ {\displaystyle \mu } 新的中性突變將變得固定。 如果在分子進化過程中看到的大多數變化是中性的，那么群體中的固定將以等于個體中性突變速率的時鐘速率積累。