CRISPR

CRISPR（成簇規則間隔短回文重復序列）是出現在許多細菌和古細菌基因組中的重復 DNA（重復）片段。 它們服務于一種機制，即 CRISPR/Cas 系統，該系統賦予對病毒或質粒入侵的抵抗力，因此是免疫系統的一部分，相當于許多原核生物。 該系統構成了用于生成轉基因生物的 CRISPR/Cas 基因工程方法的基礎。

CRISPR 基因座基本上由兩個主要部分組成：包含 cas 基因的 cas 操縱子和由前導序列和重復間隔序列（也稱為重復間隔陣列）組成的 CRISPR 陣列。

重復基本基序（重復）的各個序列的長度在 23 到 47 bp 之間變化。 重復序列與長度為 21 至 72 bp 的間隔區交替出現。 雖然重復序列保留在 CRISPR 結構中，但 CRISPR 的序列在不同的微生物中差異很大。 細菌 CRISPR 重復序列通常是回文序列（即鏡像倒置互補），導致相關 RNA 的二級結構穩定，而大多數古細菌重復序列不是回文序列。

無論是在 CRISPR 結構內還是在不同的原核生物中，間隔片段的序列差異很大。 2005 年，人們發現間隔區序列與來自噬菌體和質粒的外來 DNA 相同。 這導致了 CRISPR 的功能是保護生物體免受外來 DNA 侵害的假設。

cas操縱子也屬于CRISPR基因位點。 cas 操縱子包含 cas 基因和要編碼的蛋白質，它們是適應性免疫反應所必需的，例如 B. 解旋酶、核酸酶，以及具有 RNA 結合特性的蛋白質。 cas基因可分為兩個模塊：效應模塊和適應模塊。 效應模塊是一組用于識別遺傳物質的cas基因。 適應模塊還包含 cas 基因并使用效應蛋白來促進可以整合到細菌基因組中的原型間隔子選擇。

所謂的前導序列位于重復間隔序列附近。 前導序列是一個富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的序列，長度為 100-500 bp。 與重復一樣，基因組中的前導序列大約有 80% 相同，但在不同的每個有機體都表現出很大的差異。 作為一個非編碼序列，它可以分為兩個區域：核心前導和擴展前導。 核心前導序列在幾種生物體中是保守的，通常比擴展前導序列短，長度為 20-300 bp。 此外，核心領導者有一個啟動子元件，調節蛋白可以與之結合，以便能夠控制基因表達，更準確地說是 CRISPR 轉錄的啟動和間隔子獲取。

延伸前導長度為 50-500 bp，比核心前導長，并且還包含 CRISPR 遠距離區域中的保守序列，這可能是通過基因復制產生的。 擴展領導者的功能目前未知。 擴展領導者可能沒有重要的功能。

盡管近年來取得了重大進展，但 CRISPR/Cas 系統賦予原核生物免疫力的機制仍不清楚。 假設在免疫過程中，外源DNA被Cas蛋白復合物識別并作為新的間隔區整合到CRISPR區域。 這些過程如何詳細發生尚未完全闡明。

CRISPR/Cas 系統能夠通過在 CRISPR 陣列的重復序列之間整合外源 DNA 序列（所謂的間隔子）來修改細菌和古細菌的基因組。 這個過程稱為適應或間隔子獲取。 適配可分為兩個階段：

• 從外來 DNA 中捕獲間隔序列（所謂的原型間隔），
• 間隔整合。

除了一些例外，適應機制已在大腸桿菌 CRISPR/Cas 系統 I 型中進行了詳細研究。 適應的關鍵參與者由 cas1 和 cas2 基因編碼，它們在不同的 CRISPR/Cas 系統類型中是保守的。

適應的第 一階段，即從外來 DNA 中捕獲間隔序列，可以在 I 型 CRISPR/Cas 系統中以兩種模式發生：幼稚或啟動。 在天真適應的情況下，只有蛋白質 Cas1 和 Cas2 是捕獲間隔子所必需的，而引發的適應取決于已經存在的間隔子（引發間隔子），因此對哪些間隔子被整合到基因組中進行了預選。 除了蛋白質 Cas1 和 Cas2 之外，還需要由 Cas 蛋白質（干擾復合物 I 型，級聯）和 Cas3 核酸酶組成的蛋白質復合物。 其他 CRISPR/Cas 系統類型編碼額外的蛋白質以適應。

引發適應的機制始于 crRNA 結合蛋白復合物級聯（用于抗病毒防御的 CRISPR 相關復合物）通過促進一維擴散（沿 DNA 滑動）與入侵 DNA 的原型間隔區相鄰基序 (PAM) 的結合) 和 3D 擴散（跳躍）。 在 Cascade 彎曲和展開 DNA 后，crRNA 和 Cascade 結合的 DNA 鏈的互補堿基配對導致 R 環的形成。