T7 RNA聚合酶

T7 RNA 聚合酶是來自噬菌體 T7 的 RNA 聚合酶，T7 是一種感染大腸桿菌種腸道細菌的病毒。 該酶在重組蛋白表達的生物技術中起著重要作用。應用主要存在于大腸桿菌中，但也存在于枯草芽孢桿菌和假單胞菌中。

細菌病毒（噬菌體）T7 的第一個 RNA 轉錄本是用宿主的 RNA 聚合酶進行的。 包括啟動子特異的 T7 RNA 聚合酶的翻譯信息。 T7自身的聚合酶只識別自身的啟動子，因此是吸收宿主新陳代謝并將其用于自身繁殖的非常好的方法。 結合T7自身的啟動子，T7 RNA聚合酶被認為是一個特別“強”的表達系統。 這意味著有了這個啟動子，大量的 RNA，因此，通常可以在一段 DNA 上的每個拷貝中產生大量的蛋白質。 T7 聚合酶在轉錄延伸階段的核苷酸添加速率為每秒 200 至 260 個核苷酸（正常大腸桿菌 RNA 聚合酶每秒可達到約 40 個核苷酸）。

T7 表達系統的強大功能使得 T7 啟動子和 T7 聚合酶對于重組蛋白的表達非常有吸引力。 因此，現在出現了各種使用T7系統的蛋白表達載體，如pET系列。

通常，T7 啟動子序列及其后面（必要的 RBS 前面）“感興趣的蛋白質”的編碼區位于載體上。 由于上述原因，這種表達系統將不起作用（因為表達生物不產生 T7 聚合酶），必須將 T7 聚合酶人工引入系統。 最常見的方法是在生產生物體中將 T7 表達盒進行基因組錨定。 最常用于此的生物體是大腸桿菌。 表示基因組 T7 聚合酶的相應基因型稱為 (DE3)，因為 T7 聚合酶是在“DE3 原噬菌體”的幫助下整合到基因組中的。 在這里，T7 聚合酶的表達在 lacUV5 啟動子的控制下，可以使用 IPTG 或乳糖誘導。

使用T7表達系統會出現幾個問題：

使用過的、基因組錨定的 T7 RNA 聚合酶表達盒并不“密集”，有人說是所謂的玄武巖轉錄。 結果是始終存在一定量的 T7 聚合酶，這確保了生產生物體在實際誘導之前已經表達了蛋白質。 這是非常不利的，尤其是在有毒產品的情況下，這也意味著對生產有機體造成不必要的代謝壓力。 在啟動子和蛋白質編碼序列之間的載體上添加 lac 操縱子在這里也收效甚微。

另一種方法是 T7 溶菌酶表達盒（大腸桿菌 pLys 中的基因型名稱）的基因組錨定或添加相應的質粒。 T7 溶菌酶結合并抑制 T7 聚合酶。 然而，這種方法也意味著生產生物體的額外負擔，并且不能確保基礎轉錄方面的最佳結果。

最新的發展是不再具有 DE3 基因型的 T7 菌株，即在 lacUV5 啟動子的控制下攜帶 T7 聚合酶，但在更密集的啟動子系統如鼠李糖或阿拉伯糖操縱子下。 在這些菌株中，T7 聚合酶僅在添加適當的糖后產生。 這導致基礎轉錄顯著降低。